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行業(yè)動態(tài)

病理檢查中冰凍切片冰晶多的解決方法有哪些?

作者:小編更新時間:2024-07-26

在病理學中

冰凍切片是一種常用的技術手段
用于對組織樣本進行快速凝固和切割
以便進行顯微鏡下的觀察和分析
然而有時會發(fā)現(xiàn)冰凍切片中出現(xiàn)了過多的冰晶
影響了切片的質(zhì)量和解讀結果
今天我們就來講講
病理中冰凍切片冰晶多的解決方法

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冰晶的形成

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生物體是由細胞構成的,水在各種組織細胞中含量最多。在冰凍切片中,組織中水分極易形成冰晶,因為水在結冰時因氫鍵的交聯(lián)而膨脹,聚合形成晶體態(tài)結晶,所以標本在冷凍過程中,水分很容易形成冰晶,使切片出現(xiàn)大量冰晶孔隙以及大小空泡,造成冷凍假象,從而影響到酶和抗原的定位。
冰晶的大小與其生長速率成正比,而與形成速率(成核率)成反比,也就是冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小,對組織結構影響也愈嚴重。有文章認為冰凍開始時,冰晶形成速率較慢,以后逐漸增加,其臨界溫度為-3.3℃。從- 3.0℃降至- 4.3℃之間,形成速率急劇增加,然后再減慢。因此,在制片時首先必須做到組織在極短的時間內(nèi)驟冷速凍,才能保證鏡下觀察時沒有冰晶干擾,組織結構才能清晰,細胞形態(tài)才能完好。

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圖2 冷凍溫度與時間的曲線對照圖


細胞外冰晶和細胞內(nèi)冰晶的形成從原理來解析,都是組織降溫速度不夠快,未能使組織快速達到玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化點以下形成玻璃態(tài)凝固。如果冷凍速度足夠快,將大大減少形成冰晶,直接形成玻璃態(tài)凝固。。


秀威 冷凍包埋儀超低溫快速包埋系統(tǒng)


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  • -80℃快速冷凍,迅速達到制冷點,有效減少冰晶產(chǎn)生。

    設備制冷:室溫→ -50℃, 50-60分鐘

    樣本制冷:根據(jù)不同標本需求,10-120秒

  • 斯特林制冷技術,無需干冰、液氮、冷凍劑;
  • 面朝下包埋技術,包埋面平整減少修片;
  • 豎切(立埋)更優(yōu)秀。



防止與減少冰晶的方法



取材

?樣本取材宜新鮮,盡量保持干燥

取材時組織樣本保持干燥,不要接觸水,必要時用PBS清洗。冷凍之前用濾紙或紗布吸去組織上多余的水分。樣本盡量不要用液體浸泡,浸泡后,組織內(nèi)水分會增加,容易造成冰凍后冰品形成。

?樣本組織的大小和厚度

組織的厚度決定著速凍的時間,如果太厚,會導致標本的表面還沒有冷凍,而貼近速凍臺的一面溫度已經(jīng)太冷。在不影響實驗結果的前提下,標本取材盡量小一些,控制在1.5cmx15cmx0.3cm,厚度不超過4mm,這樣有利于組織的快速凍結,并將組織塊盡快移到冷凍頭上驟冷,以縮短冷凍時間。

預冷

?提前開機做好預冷

避免由于緩慢冷凍而產(chǎn)生冰品,宜提前開冰切機做好預冷。將冰凍切片機的溫度降至-20℃~-25℃。一般將冷凍箱溫度降至-25℃℃,冷凍頭溫度降至-30℃。

?保持刀具與臺面的干燥

取材時盡量保持刀具與臺面的干燥,避免組織與水接觸,如送檢組織內(nèi)含水或血性液體,應用干的紗布或濾紙把水分吸干后再行冷凍。

OCT包埋和速凍

?單獨OCT包埋劑包埋和速凍

樣品托放上速凍臺,加入少量OCT包埋劑,待底部變白但表面未凝固時放上組織樣本,適當加蓋少量包埋劑,加冷凍錘速凍組織(注意保持組織冷凍切面的水平)。這樣既可以提高冷凍速度,又可以避免接觸空氣后產(chǎn)生干、濕影響。

切片

?冰凍切片厚度適中

冰凍切片不能太薄,一般≧6um,6um的片子可以有更多的空間避免風干假象,也會減少冰晶所造成的細胞核空洞。


總之,掌握“三度”是解決冰晶問題的關鍵,即濕度、溫度、速度。


參考文獻:

毛成毅,杜娟,肖華亮,李增鵬.不同組織冰凍切片體會. 2017.


(來源:微信公眾號:病理海)


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